磁共振成像观察SPIO标记脂肪干细胞在脑梗死大鼠脑内的迁徙和分布

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.005

摘要/Abstract

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文题释义：

干细胞示踪技术：通过一定的方式，对干细胞移植后活体内迁徙和增殖情况等进行监测的技术。通过干细胞示踪，可以监测移植细胞在体内的存活、迁移及分化等情况，便于在移植后及时了解移植细胞的转归等。干细胞示踪技术主要包括同位素示踪法、抗原标记法、荧光蛋白标记法、荧光染料标记法、核磁共振对比增强剂标记法、Lac-Z 基因标记法、Y染色体标记法等。

超顺磁性氧化铁：是一种新型的生物医学纳米材料，具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。由于大多具有磁响应性和超顺磁性等磁特性，在进入体内后能够增加周围质子的弛豫时间(T2)，从而产生磁共振成像信号，所以在细胞磁性分离、靶向药物传递和磁共振成像剂等方面有着广泛的应用。

背景：采用无创伤性影像技术跟踪移植后干细胞的存活状态及与宿主组织整合情况，是近几年国内外学者关注的问题。

目的：观察超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞移植后在脑梗死大鼠脑内的分布和迁徙情况。

方法：建立大鼠脑梗死模型，随机分为超顺磁性氧化铁记组和未标记组，造模后1 d，脑内分别注射超顺磁性氧化铁标记的脂肪干细胞悬液10 μL和未经超顺磁性氧化铁标记的脂肪干细胞悬液10 μL。在移植后1，7，14 d进行NSS评分，并用磁共振成像方法观察超顺磁性氧化铁标记的脂肪干细胞的分布情况。

结果与结论：移植后7，14 d两组大鼠NSS评分显著低于移植后1 d，差异有显著性意义(P < 0.05)。各时间点两组之间进行比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。移植后14 d，磁共振检测发现移植区域存在低信号区，细胞在大鼠脑内发生迁徙，从胼胝体迁徙至病变区。实验结果提示脂肪干细胞脑内移植可以有效促进脑梗死大鼠神经功能恢复，磁共振成像可以评估超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞移植后在脑内的分布以及迁徙情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-8196-2073 (陈龙华)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 超顺磁性氧化铁, 脑梗死, 干细胞移植, 标记, 磁共振成像, 细胞迁徙

Abstract:

BACKGROUND: To trace the survival status of transplanted stem cells and the integration with host tissues using non-invasive imaging techniques are the focus of research in recent years.

OBJECTIVE: To observe the distribution and migration of superparamagnetic iron oxide (SPIO)-labeled adipose-derived stem cells in the brain of rats with cerebral infarction.

METHODS: Rat models of cerebral infarction were established and randomized into SPIO-labeled group and unlabeled group. At 1 day after modeling, the rats in the two groups were given SPIO-labeled adipose-derived stem cell suspension (10 μL) and unlabeled adipose-derived stem cell suspension (10 μL) into the brain, respectively. At 1, 7, 14 days after cell transplantation, neurological severity scores were measured, and MRI was used to observe the distribution of SPIO-labeled adipose-derived stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: At 7 and 14 days after transplantation, the neurological severity scores in the two groups were significantly lower than those at 1 day after transplantation (P < 0.05). However, there was no difference in the neurological severity scores between the two groups (P > 0.05). At 14 days after transplantation, MRI findings showed low signals in the transplanted region, indicating the cells migrated from the corpus callosum to the lesion. These findings suggest that intracerebral transplantation of adipose-derived stem cells can promote neurological recovery from cerebral infarction in rats, and MRI can be used to visualize the distribution and migration of SPIO-labeled adipose-derived stem cells in the brain.

陈龙华. 磁共振成像观察SPIO标记脂肪干细胞在脑梗死大鼠脑内的迁徙和分布[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(6): 793-798.

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图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2014年9月至2015年5月在南阳高等医学专科学校第一附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康SD大鼠25只(5只SD大鼠用于细胞培养，20只SD大鼠用于造模)，2-4个月龄，体质量为200-300 g。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.3.2 主要试剂与仪器 PBS(潍坊瑞华生物科技有限公司)；胰蛋白酶(上海博升生物科技有限公司)；L-DMEM培养液(美国GIBCO/BRL公司)；胎牛血清(HyClone公司)；多聚左旋赖氨酸(北京高科恒辉技术发展有限公司)；Feridcx(长春亚信生物电子有限公司)；孵育箱(上海義森生物科技有限公司)；普鲁士蓝染色(上海惠诚生物科技有限公司)；锥虫蓝染色(北京宝赛生物技术有限公司)；水合氯醛(上海飞轩生物科技有限公司)；庆大霉素(北京百龙腾科技发展有限公司)；1.5 T超导磁共振成像系统 (SIEMENS Sonata)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠脂肪干细胞分离与培养取5只SD大鼠，无菌条件下获取腹股沟处脂肪组织，PBS洗涤，用剪刀将脂肪组织剪为小块，参照文献[8]进行大鼠脂肪干细胞分离、培养、鉴定。

1.4.2 超顺磁氧化铁标记大鼠脂肪干细胞及细胞活性检测利用含胎牛血清的L-DMEM培养液对Feridcx进行稀释，添加多聚左旋赖氨酸，置于37 ℃环境下孵育1 h。取第3代脂肪干细胞利用上述培养基进行机械吹打，获得细胞悬液，接种在培养瓶中。连续培养12 h后取出，离心后收集沉淀，PBS洗涤，更换新的培养基进行培养，培养2 d之后收集细胞，保存备用。取第3代超顺磁氧化铁标记大鼠脂肪干细胞进行普鲁士蓝染色。取第3代超顺磁氧化铁标记大鼠脂肪干细胞与未经标记的脂肪干细胞进行锥虫蓝染色，计算拒染率。

1.4.3 脑梗死大鼠模型建立与分组 20只SD大鼠随机分为2组：超顺磁氧化铁标记组和未标记组，每组10只。按照线栓法构建大鼠脑梗死模型，栓塞侧均选择大鼠右侧大脑。①整个过程在10×手术显微镜下进行，利用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，达到麻醉效果之后剪掉颈部毛发，常规消毒铺巾，于右侧鼓泡做切口，斜向内至大鼠胸骨上窝正中部位。②钝性分离皮下组织及甲状腺，可见颈前肌和胸锁乳突肌构成的三角形间隙，分离其上的筋膜，将胸锁乳突肌以及颈前肌分别拉向两侧，即观察到搏动的颈总动脉，伴有迷走神经，分离迷走神经和颈总动脉。③从颈总动脉远心端分离出颈内动脉(下)和颈外动脉(上)，沿颈内动脉向下分离并结扎翼腭动脉。④结扎颈总动脉近心端，利用血管夹夹闭颈总动脉远心端，并在二者之间放置丝线，打结。利用眼科剪在结下方0.5 cm左右剪一小孔，插入线栓头端，将丝线收紧并去掉血管夹。⑤将栓线经颈内动脉沿着颈总动脉送入颅内，进入18 cm左右感到阻力停止，对线栓进行结扎固定。利用庆大霉素对术区进行冲洗，分层缝合大鼠皮肤。手术结束之后，待大鼠麻醉清醒，如果大鼠行走时向右侧转圈，则视为模型建立成功。

1.4.4 超顺磁氧化铁标记大鼠脂肪干细胞脑内移植造模后1 d，将大鼠麻醉后固定于立体定位架上，以前囟尾侧0.8 mm，中线右外侧1.2 mm为注射点，深度为硬膜下3.0-3.2 mm，超顺磁氧化铁标记组注射1×10⁹ L^-¹脂肪干细胞悬液10 μL，留针10 min，缓慢退针，缝合头皮。未标记组采用相同的方法注射相同剂量未经超顺磁氧化铁标记的脂肪干细胞。术后常规喂食、喂水。

1.4.5 磁共振成像检测脂肪干细胞脑内移植治疗1，7，14 d，利用1.5 T超导磁共振成像系统(3英寸鸟笼线圈)对超顺磁氧化铁标记组进行磁共振检测，层厚2 mm，层间距0，FOV 9 cm×9 cm。

1.4.6 NSS评分移植后1，7，14 d对两组大鼠进行NSS评分，观察指标包括动物的运动、感觉功能、平衡能力、生理反射。总分18分，0分为正常，得分越高表示其神经损害程度越严重。

1.5 主要观察指标 ①大鼠脂肪干细胞形态。②锥虫蓝染色结果。③两组大鼠NSS评分。④磁共振成像检测脂肪干细胞在大鼠脑内的分布。

1.6 统计学分析利用统计学软件SPSS 19.0进行统计学分析，进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

以往治疗脑梗死大多采取对症处理、营养神经、活血化瘀等保守疗法，效果并不理想^[9-15]。与传统治疗方法相比，干细胞移植是治疗神经系统疾病的一个方向。细胞移植后可以在体内分化成神经元，也可激活内源性神经干细胞，对损伤脑组织进行修复，从而达到治疗疾病的目的^[16-21]。同时，通过旁分泌作用促进干细胞增殖，从而恢复神经细胞的正常功能，改善大脑认知功能障碍和各种减退的功能，为脑梗死患者的康复提供了新的方法^[22]。

2001年，Zuk等^[23]学者从人抽脂术中获得的脂肪组织中获得一种具有多向分化能力的干细胞，这种干细胞即为脂肪干细胞。脂肪干细胞来源广泛，体外培养方法简单，且具有良好的分化潜能^[24-26]。对干细胞在体外进行标记，有利于观察细胞移植后的分布和迁移情况。目前，可选择的干细胞标记方法有核酸标记物标记和转基因标记等^[27]，这些方法具有侵袭性，需要在细胞移植后的一定时间内获得组织标本，并通过制备切片和免疫组化染色观察标记结果^[28]，无法实现动态观察干细胞移植后迁移情况，另外也不适合用于人体研究，因此存在一定的不足之处^[25]。为此，需要寻求一种非侵袭性的活体示踪方法对移植干细胞进行动态观察，以了解细胞移植之后的分化和迁移情况^[29]。

磁共振成像是一种安全、无创的影像学检查方法，且具有较高的组织分辨率和空间分辨率^[30]。磁共振检测观察宿主细胞与移植干细胞时容易出现混淆。为此，需要使用造影增强剂，以更好地对上述两种细胞予以区分^[31]。超顺磁性氧化铁(SPIO)是一种常用的造影增强剂，可用于免疫追踪以及树突状细胞等细胞的标记^[32-33]。Gambarota等^[34]学者通过研究指出，与常规造影增强剂比较，氧化铁类造影增强剂具有更高的磁敏感度。Mou等^[35]学者通过研究发现，超顺磁性氧化铁具有良好的生物相容性，是一种安全的造影增强剂。刘再毅等^[36]通过左旋多聚赖氨酸-超顺磁性氧化铁共培养的方式对脂肪干细胞进行标记，植入大鼠心脏中，并在术后进行磁共振示踪成像动态观察，发现细胞在大鼠体内良好存活，并发生迁徙。实验即选择超顺磁性氧化铁对干细胞进行标记^[37]，为分析超顺磁性氧化铁标记是否会对干细胞的活性产生影响，进行了锥虫蓝染色实验。锥虫蓝染色实验的原理：在正常状态下，锥虫蓝无法通过细胞膜，但当细胞死亡或者出现损伤的时候，细胞膜的通透性会发生改变，锥虫蓝可以通过细胞膜与解体 DNA发生结合，并对其进行着色^[38-39]。因此，通过锥虫蓝实验可以较为直观了解细胞的活性^[40]。结果发现两组细胞锥虫蓝拒染率差异无显著性意义，表明超顺磁性氧化铁标记不会对干细胞的活性产生影响。取第3代磁标记大鼠脂肪干细胞进行普鲁士蓝染色，可以观察到细胞胞质内存在大量的蓝染铁颗粒，表明超顺磁性氧化铁标记成功。治疗后7，14 d两组大鼠NSS评分显著低于治疗后1 d，差异有显著性意义(P。各时间点两组之间进行比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明脂肪干细胞移植治疗脑梗死大鼠可以获得良好的效果，且超顺磁性氧化铁标记不会对治疗效果产生影响。大鼠脂肪干细胞脑内移植后1，7，14 d进行磁共振检测，在移植部位可见低信号区，14 d后局部可见稍低信号区但信号较1，7 d时增高。经T1、T2、T2*GRE扫描之后均可以观察到存在低信号区，经磁标记的脂肪干细胞在脑内发生迁徙，从胼胝体迁徙至病变区。上述结果显示，移植后的干细胞可以在移植部位发生分化并进行迁徙，导致信号缺失出现减弱、范围扩大。而标记后通过MRI检测，则可以及时的了解到移植细胞在体内的动态变化。 < 0.05)

综上所述，通过超顺磁性氧化铁标记与磁共振成像检测可以了解干细胞移植后的生物学行为，为临床治疗提供更多的参考依据。